组织透明化技术发展及其在神经退行性病中应用

　　【摘要】现代组织透明化技术使细胞群的高分辨率成像和组织结构的三维重建成为可能，我们通过组织透明化技术可以获得更完整的脑部三维结构以及脑组织各个组分的空间联系。在过去的十年里，科学家们对组织透明化技术进行了大量的开发与改进，这些方法目前被广泛的运用在神经科学的研究中，使我们在复杂的神经网络中得到重要的信息。同时，组织透明化技术也会为神经退行性疾病的干细胞治疗和神经再生提供研究工具。在这篇综述中，我们主要回顾了一下目前主要的组织透明化技术的种类以及优缺点，并且总结了一下这些技术在神经退行性疾病研究中的应用以及独特的优势，此外我们还探讨了未来组织透明化技术的发展要求，配套设备的完善以及在干细胞治疗和再生医学中作为研究工具的潜力。

　　【关键词】组织透明化技术；神经退行性疾病；再生医学

　　神经退行性疾病包括阿尔茨海默病（Alzheimerdisease，AD）、帕金森病（Parkinsondisease，PD）、亨廷顿病（Huntingtondisease，HD）、肌萎缩侧索硬化（amyotrophiclateralsclerosis，ALS）和额颞叶痴呆（frontotemporaldementia，FTD）等，这类疾病影响着全球数百万人，造成巨大的社会和经济负担。尽管全球科学家围绕神经退行性疾病进行了深入的研究，但是当前仍没有有效的疗法可以治愈或阻止其发展。因此，如何深入了解发病时脑部的结构，功能及其病理改变是发展有效的治疗策略所必需要解决的问题。

　　1脑组织透明化方法

　　近年来，各种各样的组织透明化方法逐渐被开发使用，不仅可以进行多色成像还可以对复杂组织中的几个特定目标进行成像。除了对荧光蛋白进行成像，这些方法大多还允许对荧光团偶联的蛋白质、抗体、纳米颗粒和原位荧光RNA探针杂交（FISH）进行追踪成像[10]。本文将详细比较几种组织透明化方法，最近发表的相关综述见文献[11-12]。在讨论组织透明化对于神经病理学的研究的作用之前，我们将首先简要介绍目前主要的三类组织透明化方法包括疏水性组织透明化、亲水性组织透明化和水凝胶透明化的基本原理及主要优缺点（表1）

　　1.1疏水性组织透明化

　　1.1.1苯甲醇-苯甲酸苄酯（BABB）透明技术脑组织透明化的初次问世可以追溯到2007年，研究者使用苯甲醇和苯甲酸芐酯（benzylalcohol/benzylbenzoate，BABB）的混合物透明化小鼠大脑，开发了BABB透明技术，获得了老鼠脑神经网路[13]，成功使小鼠脑部透明化，观察到了标记绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）的神经元细胞，与之前的全脑成像采用的电子计算机断层扫描（computedtomography，CT）和核磁共振成像（magneticresonanceimaging，MRI）的方法相比，首次实现了单细胞分辨率的全脑观察。通过脑部的透明化，研究者观察到了标记GFP的单个神经元和脑部的天然荧光体，同时重构了海马体中的树突细胞。但在技术方面还是存在很多的限制—需要成像媒介，透明化不完全，依然存在很高背景，而且此技术使用的透明媒介会使荧光标记迅速消失，因此不适合多次观察等。

　　1.1.2iDISCO和vDISCO全组织包埋免疫标记的三维成像技术（immunolabeling-enabledthree-dimensionalimagingofsolvent-clearedorgans，iDISCO）是一个简单，快速，可进行整体免疫标记的稳定、可扩展的廉价方法。iDISCO可以进行深层组织结构的体积成像[14]。研究者认为GFP标记手段并不是非用不可的手段，通过整体的免疫标记替代表达的GFP在实现成像功能的同时可以进行更多的信息观察，而且通过整体的适应性调整改进了现有的免疫标记技术，实现了最佳信噪比和最大深度的脑部成像。研究者还调研了其他的透明化方法，筛选了更加稳定和快速的免疫标记抗体[15]。这使得研究人员开发的iDISCO具有更好的免疫染色相容性。

　　1.2亲水性组织透明化

　　1.2.1Scale和ScaleS2011年提出的基于尿素的透明技术（Scale）可以在更短的时间完成组织的透明化，同时相比于其他试剂透明化的效果更好[22]，可以有效的防止荧光的淬灭。这种试剂的使用综合考虑了多方面的因素，包括折射率、pH等，组织透明化效果更好，成像分辨率更高，更重要的是，这种试剂用于非脑组织的透明化效果亦佳。

　　1.2.2CUBIC2014年，日本科学家开发了一种简单、高效、可扩展的智能透明化系统和计算分析方法CUBIC，使单光子快速全脑成像成为可能[24]。这种方法可以应用于不同荧光蛋白的全脑标记成像和成人脑组织免疫染色及其影像学研究。CUBIC从灵长类脑成像到亚细胞结构成像如轴突和树突棘都有很好的成像效果和分辨率[25]。为了进行个体间的比较，研究者还开发全脑细胞核反义标记法和图像分析方法。CUBIC具有跟踪基因表达的能力，同时可以达到单细胞的分辨率，开发的智能分析系统，可以实现了对图像的优化分析以及信息提取。

　　2脑组织透明化技术在神经退行性疾病研究中的应用

　　每一种神经退行性疾病都会影响特定的大脑回路，但是不同的疾病也有几个共同的病理生理特征，包括因蛋白质聚集体的积累形成的神经病变等。AD的神经病理学有淀粉样蛋白聚集和高磷酸化的tau蛋白引起的细胞外淀粉样斑块沉积和神经内神经纤维缠结（NFT）；α-突触核蛋白内含物，称为路易小体，在PD患者中发现；突变型亨廷顿蛋白（mHTT）聚集体在HD患者中发现；TAR-DNA结合蛋白43（TDP-43）的聚集物在ALS和FTD大脑中发现[34]。其中一些病变（如淀粉样斑块沉积、路易小体和TDP-43聚集体）存在于多种疾病中，表明不同的疾病可能有相同的分子机制。但是，不同的神经退行性疾病也有着其独特的神经回路特征[35]，因此我们需要在包含多个脑区的全脑尺度上大尺度上对不同疾病的神经回路进行研究。

　　3脑组织透明化技术在干细胞治疗以及再生医学中的潜力

　　干细胞治疗在AD的临床前模型中有着很好的应用前景，但仍需进一步的研究才能解决多方面的实际问题和理论问题。例如，我们仍然不确定将这些细胞输注到大脑的最佳方法。AD的复杂性，在疾病的发展过程中没有多个层次的病理变化，导致难以优化单一细胞类型的治疗，以扭转所有的认知和行为症状。这是潜在的细胞疗法面临的主要障碍之一。研究人员也认为，目前关于大脑神经再生的研究，包括他们进行的这项研究，都存在一个问题。这些研究全都是通过一些标志物来间接的检查神经发生，这可能无法可靠的证明有新的神经元生成[47]。希望能有更为准确可靠的研究方法被开发出来。因此，通过组织透明化技术我们可以的到完整的大脑神经网络获得更全面的信息，帮助我们进行干细胞追踪、评价以及神经元变化的观察。

　　4总结与展望

　　对生物体脑部进行全细胞分析和神经网络观察是生物医学领域的主要挑战之一。组织透明技术结合光学成像和图像处理技术，能够将整个脑部快速透明并进行结构和细胞分析，为在生命科学中应用先进的光学技术提供了一个非常有前景的解决方案。组织透明化技术在过去几年的惊人发展但其仍然有很多改进的空间。最近的一些综述阐述了组织化学需要提供更优化的技术方案以及更加优良不会影响成像效果以及组织完整性的透明化试剂，需要开发更适合全脑成像以及透明化后观察的光学显微镜，得到更高分辨率和清晰度的图像，增强这种方法的适应性。同时在固定样品观测中应提高当前分辨率和可观测的生物分子的范围（即脂类、糖类等）、修饰（乙酰化、甲基化、苏木酰化等）和变化过程（核酸蛋白相互作用、物质合成、降解和聚合等）[48]。另一方面，在生物微机械系统容积成像中的应用以及使用三维人脸重建模型(largescalefacialmodel，LSFM)的生物微器件实现体外三维重构和亚细胞成像都需要高度可控的实验条件。获得图像之后需要发展强大的计算工具，实现对数据的分析，统计以及可视化处理，并且完善神经病理学分析软件与获得的数据图像分析有机结合，建立标准化的数据格式以及共享平台，提高数据处理速度以及大数据的分析，建立大脑功能以及细胞组学信息库[49]。为了结合其他结构和功能成像技术〔如正电子发射断层摄影术（PET）、功能磁共振成像（fMRI）、多光子显微镜、光学超分辨率成像、冷冻电镜和冷冻电子断层摄影术等〕需要建立适应性的组织清理技术以及对其的扩展。如何实现完整的大空间尺度的成像用来评估大脑的相关功能，仍然是当代神经科学最具挑战性的任务之一[50]。目前组织透明化技术及其扩展技术已经被广泛的应用于神经退行性疾病的研究，而且被神经科学领域广泛的认可。相信在不久的将来我们可以获得更多神经科学相关的信息，用于疾病的治疗以及神经活动的探索。

　　参考文献

　　[1]MIYAWAKIT，MORIKAWAs，SUSAKIEA，etal。VIsualizatlonandmolecularcharacterlzatlonofwhole-bralnvascularnetworkswlthcapillaryresolution。NatCommun，2020，11(1):1104[2021-03-29]。

　　[2]LICHTMANJW，DENKW。Theblgandthesmall:Challengesoflmaglngthebrain'sclroults。Sclence，2011，334(6056):618623。

　　[3]KRAMERCK，SHAWLJ，CHANDRASHEKHARYProgressIncardlovascularImagingJacc-CardlovascImag，2018，11(12):1883-1914。

　　谷沛霖1，2，沈建磊3，诸颖4，李江4，王丽华4△